在脑科学领域，针对神经系统疾病的机制和治疗研究离不开对大脑结构和功能的深入了解。对全脑进行整体成像能够帮助研究者从宏观尺度探究不同生理和病理状态下的大脑结构与功能差异。通过物理化学方法，在保留组织和蛋白质结构的前提下，让生物组织变得透明，从而实现荧光3D成像，是目前最为直接有效的技术手段。然而，由于受到多种因素的干扰，组织透明化后的免疫荧光染色仍是领域内的难点问题之一。

图一：TSA-PACT方法流程图

2023年5月26日，华中科技大学同济医学院法医学系熊博课题组与协和医院内分泌科孙晖课题组合作在美洲华人生物学家协会官方学术期刊Cell & Bioscience (IF=9.584)上在线发表了题为TSA-PACT: a method for tissue clearing and immunofluorescence staining on zebrafish brain with improved sensitivity, specificity and stability的研究论文。该研究基于PACT技术，开发了以TSA荧光催化与放大体系为特征的透明组织整体荧光成像新方法。通过优化后的简便的操作，使斑马鱼大脑整体透明化，利用少量的抗体即可完成斑马鱼全脑神经网络三维标记。此外，该方法显著提高了荧光信号的强度及信噪比，获得了清晰的神经元形态和分布；利用TSA底物与丙烯酰胺水凝胶网络共价结合的特性，增加了信号标记的稳定性，实现荧光信号的长久保存，放置16个月以上的组织仍然能够进行清晰的重复成像，并允许多轮荧光标记操作，满足多种成像的需求。作为对该方法的验证，课题组使用该技术进行了神经纤维、神经元胞体、浦肯野纤维网与星形胶质细胞的标记与荧光成像，呈现出良好的标记效果，提供了丰富的可视化信息，适用于脑精细结构分析、神经网络绘制和三维细胞计数。通过使用HuC/D与GFAP抗体共同标记，可从三维尺度观测星形胶质细胞与神经元的相对空间位置，探索其相互作用。通过全脑三维增殖期细胞计数，验证了高糖环境对发育期斑马鱼大脑细胞增殖的抑制作用，证明了TSA-PACT技术在疾病研究中的潜在应用价值。

图二：全脑神经网络，细胞定位，三维细胞计数

值得一提的是，本项目的开展起始于本科生创新项目“基于PACT技术的斑马鱼组织透明化实验体系的建立与应用”。2019年初，八年制临床医学专业大三年级学生余雨欣和徐银慧同学申报了相关大创项目并获批。经过一年的研究训练，项目取得了初步进展并顺利结题。然而当时仍有许多技术细节需要进一步完善。此后三年时间里，两位同学在博士生王康的帮助下，在熊博教授和孙晖教授的指导下，继续利用课余时间反复研究，不断优化实验流程，终于取得了较好的实验结果。而后，余雨欣和徐银慧同学全程参与了数据的整理，论文的写作、投稿、补实验、返修等过程，获得了充分的科研训练，并实现了将大创项目的成果发表在学术期刊上的目标。华中科技大学熊博教授和孙晖教授为本论文的共同通讯作者，法医学系王康博士（现为南京医科大学专任教师）、八年制临床医学专业余雨欣和徐银慧为该论文的共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、华中科技大学创新研究院技术创新基金和江苏省高等学校自然科学研究基金的支持。

原文链接：

https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-023-01043-1